双荧光素酶本质的旨趣是诈骗荧光素酶与底物集结发生化学发光反映的性情，把感兴味的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶申报质粒。然后转染细胞欧洲杯体育，符合刺激或管理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的上下判断刺激前后或不同刺激对感兴味的调控元件的影响。同期，为了减少内在的变化要素对本质准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒当作对照质粒与申报基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试效果不受本质条目变化的搅扰。

发光旨趣

双萤光素酶本质的具体法子

1、申报基因质粒的构建。将标的片断插入到荧光素酶抒发的申报基因载体上，如pGL3-basic。

2、转染细胞。将申报基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，凭据需要对细胞进行管理。共转染时，由于内参具有很强的开动子，因此申报基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

Luciferase活性测定：⑴ 初度使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II融化在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，不祥拆开LAR II的反映。⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，奏乐混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。⑸ 数据管理。领先策画出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单元1，即可获取不同管理组的相对luciferase活性，也等于该管理组基因转录的调控活性。

效果解读

文件一：PMID: 28697764；IF=41.444

（1）法子

（2）效果

考证linc00673和miR-150-5p的集结情况。野生型linc00673可与miR-150-5p集结，但突变型linc00673却不成。通过构建荧光素酶申报载体，将荧光素酶与linc00673基因说合，然后转染到细胞内检测荧光活性。效果标明，miR-150-5p mimics权贵缩小了野生型linc00673的荧光素酶活性，但对突变型linc00673荧光素酶活性莫得影响。以上效果标明，linc00673可与miR-150-5p集结。

文件二：PMID: 35963157；IF=5.741

（1）法子

（2）效果：

考证YAF2和miR-217-5p的集结情况。野生型YAF2可与miR-217-5p集结，但突变型YAF2却不成。通过构建荧光素酶申报载体，将荧光素酶与YAF2基因说合，然后转染到细胞内进行检测。效果标明，miR-217-5p mimics权贵缩小了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2荧光素酶活性莫得影响。以上效果标明，YAF2可与miR-217-5p集结。

文件三：PMID: 35212607；IF=6.832

（1）法子

（2）效果

本征询考证了PEG10和miR-449a以及RPS2与miR-449a的集结情况。这里以PEG10和miR-449a为例。野生型PEG10可与miR-449a集结，但突变型PEG10却不成。通过构建荧光素酶申报载体，将荧光素酶与PEG10基因说合，然后转染到细胞内进行检测。效果标明，miR-449a mimics权贵缩小了野生型PEG10的荧光素酶活性，但对突变型PEG10荧光素酶活性莫得影响。评释PEG10与miR-449a靶向集结。

文件四：PMID: 35110549；IF=9.685

（1）法子

（2）效果

考证PAARH和HOTTIP辨认与六种miRNA的集结。以上效果清楚，miRNA转染组的荧光活性权贵缩小，标明miRNA与PAARH和HOTTIP之间存在靶向集结。

留意该征询中莫得突变型的效果，这么的例子很少，一般荧光素酶的效果是需要包括突变型和野生型的，我方设想本质的本领留意一下。

所用耗材：

NEST酶标板

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